长牡蛎Caspase家族蛋白调控细胞凋亡的机制研究

• Main Author: 徐家超
• Other Authors: 宋林生
• Format: Other/Unknown Material
• Language: Chinese
• Published: 2016
• Subjects: 长牡蛎; 细胞凋亡; Cgcaspase-3; Cgcaspase-8; Lps; 免疫应答; Crassostrea gigas
• Online Access: http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/116965

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种，它主要由半胱氨酸蛋白酶介导执行，这类半胱氨酸蛋白酶被称为Caspase。细胞凋亡在细胞内稳态的维持，组织与器官发育以及免疫防御等方面都发挥着重要作用。目前在高等生物中，Caspase家族蛋白及其介导的凋亡调控通路已研究得较为透彻，而对无脊椎动物，尤其是软体动物的研究还十分有限。本研究以长牡蛎（ Crassostrea gigas ）为研究对象，利用分子生物学、细胞生物学以及生物信息学等相关技术手段，对长牡蛎Caspase-3（命名为 Cg Caspase-3）、Caspase-8（命名为 Cg Caspase-8）的功能及其介导的凋亡调控机制进行了初步的研究。 Cg Caspase-3基因的开放阅读框（ORF）为924 bp，编码307个氨基酸， Cg Caspase-8基因ORF全长为1455bp，编码484个氨基酸。 Cg Caspase-3和 Cg Caspase-8分子皆为酶原形式，包含典型的CASc结构域及酶活性位点。 Cg Caspase-3和 Cg Caspase-8 mRNA在各组织中皆呈组成性表达，且都在外套膜及血淋巴细胞中表达量较高，性腺中较低。在长牡蛎个体发育各个阶段（2细胞期-壳顶期）， Cg Caspase-3和 Cg Caspase-8 mRNA皆有表达，但表达模式不同。细胞内定位显示， Cg Caspase-3分子少量分布于细胞核中，而 Cg Caspase-8分子仅分布于细胞质中。 Cg Caspase-3酶原形式已具有催化活性，倾向于Asp-Xaa-Xaa-Asp (DXXD)形式底物。而Caspase-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO及Caspase家族蛋白酶泛抑制剂Z-VAD-FMK都对r Cg Caspase-3酶活性有显著的抑制效果。胞内实验同样表明 Cg Caspase-3可以诱导细胞凋亡。此外， Cg Caspase-3具有模式识别受体（PRR）的功能，LPS亲和层析、基于ELISA原理的LPS结合实验以及胞内共定位检测都表明 Cg Caspase-3可以直接结合LPS，而表面等离子共振（SPR）检测发现与LPS结合具有高度特异性，其解离常数( K D )为1.08×10 -6 M，未检测到 Cg Caspase-3与磷壁酸、甘露聚糖及葡聚糖的结合活性。 Cg Caspase-3截短体重组蛋白r Cg Cas-3 (NT)及r Cg Cas-3 (ΔN58)与LPS结合能力均显著降低。体外检测环境下，LPS可以抑制r Cg Caspase-3的活性，且呈现剂量效应。而胞内LPS同样可以抑制 Cg Caspase-3对底物（PARP）的水解活性，抑制细胞凋亡。 Cg Caspase-8分子对Caspase-8的底物（Ac-IETD- p NA）水解活性微弱，激活后，其活性有一定程度提高，并且r Cg Caspase-3可在r Cg Caspase-8作用下发生水解，形成约20 kDa和11 kDa小片段。 Cg Caspase-8可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，其Caspase-8特异性抑制剂Z-IETD-FMK对 Cg Caspase-8酶活性具有显著抑制作用。胞内共转染 Cg Caspase-3与 Cg Caspase-8实验表明， Cg Caspase-3与 Cg Caspase-8完全共定位，两者可能存在相互作用。 Cg Caspase-8能够响应LPS、PGN及灿烂弧菌刺激，其中对LPS和灿烂弧菌刺激响应强烈。LPS刺激后， Cg Caspase-8 mRNA及蛋白表达水平皆显著上升，后逐渐下降。而灿烂弧菌刺激， Cg Caspase-8 mRNA表达量同样在3 h达到峰值，其后下降，而蛋白表达量则从0 h后逐渐降低，mRNA表达水平变化与蛋白水平不同。 上述研究结果表明，与脊椎动物相比，长牡蛎Caspase家族成员 Cg Caspase-3和 Cg Caspase-8分子在进化上高度保守，具有典型的CASc结构域及半胱氨酸水解酶活性，皆可介导细胞凋亡，并可响应不同的免疫刺激。同时研究发现长牡蛎存在特殊的凋亡调控机制，LPS可以抑制 Cg Caspase-3介导的细胞凋亡，这在其他高等生物及无脊椎生物中从未报道。这种特殊的调控机制可能在长牡蛎免疫防御中发挥重要作用。研究结果为深入研究无脊椎动物Caspase家族蛋白功能及凋亡调控机制奠定了重要基础。